1、实验准备与环境检查

 

　　在超净台或专用PCR准备区进行试剂配制，避免外源DNA污染。穿戴手套、口罩和实验服，使用无DNA酶的耗材（如PCR管、枪头）。检查扩增仪电源连接是否正常，确认热盖（HeatedLid）硅垫清洁无破损，加热块适配所用PCR管或板型（0.2mL单管、8联管或96孔板）。

 

　　2、配制PCR反应体系

 

　　根据实验需求，精确配制反应混合液（MasterMix），包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶、缓冲液等。建议在冰上操作，防止酶提前激活。将混合液分装至PCR管或板中，盖紧管盖，避免气泡产生。

 

　　3、装载样品并关闭热盖

 

　　将PCR管或板整齐放入仪器加热块中，确保每个样品与模块充分接触。轻柔关闭热盖，使其压紧PCR管盖，防止高温循环中管盖爆开或液体蒸发。若使用无热盖机型，需在每管中加入矿物油覆盖。

 

　　4、程序设置与启动

 

　　打开控制面板或连接软件，新建或调用预设程序。准确设置三步循环参数：

 

　　变性：通常94–98°C，20–30秒

 

　　退火：根据引物Tm值设定，50–65°C，20–30秒

 

　　延伸：72°C，按1kb/min计算时间

 

　　设置循环数（通常30–40次），以及初始变性和最终延伸步骤。确认无误后启动程序，仪器将自动开始温控循环。

 

　　5、运行监控与结束操作

 

　　运行期间可通过屏幕观察实时温度曲线，确保各阶段温度准确。程序结束后，仪器通常会自动降温至4–10°C保存样品。此时方可打开热盖，取出PCR产物，立即进行后续分析（如电泳、测序）或–20°C保存。